Luce e sue proprietà. Fondamenti di ottica. Molecole e interazione radiazione-materia. Microscopia ottica. Manipolazione ottica. Metodi di marcatura mediante sonde fluorescenti. Microscopia a scansione laser. Microscopia vibrazionale. Super-risoluzione. Applicazioni biologiche.
- J. Mertz "Introduction to Optical Microscopy"
- "An introduction to single molecule biophysics", edited by Yuri L. Lyubchenko
Obiettivi Formativi
Ampliare le conoscenze degli studenti nel campo delle tecniche di microscopia avanzate utilizzate nelle moderne applicazioni biologiche e biomediche.
Prerequisiti
Fondamenti di fisica - Matematica di base
Metodi Didattici
Lezioni frontali e esperienze di laboratorio
Altre Informazioni
N.D.
Modalità di verifica apprendimento
Esame orale consistente nella presentazione di un articolo scientifico sulle tematiche affrontate a lezione e verifica della comprensione delle stesse.
Programma del corso
Introduzione
1. Luce e proprietà (3 ore) – Radiazione Elettromagnetica – Campo Elettromagnetico - Onde – Equazioni di Maxwell – Proprietà della Radiazione Elettromagnetica: monocromaticità, coerenza, polarizzazione - Dualismo onda-corpuscolo - Fotoni – Spettro ed Energia - Indice di rifrazione – Interferenza
2. Ottica Geometrica (3 ore) – Postulati dell’ottica geometrica – Principio di Fermat – Riflessione da uno specchio piano, sferico, parabolico e ellittico – Rifrazione tra due mezzi separati da una superficie piana – Legge di Snell – Rifrazione da una superficie sferica – lenti sottili convergenti e divergenti – formazione delle immagini - telescopio
3. Molecole e interazione con luce (3 ore) - Struttura elettronica –Interazione con luce – Assorbimento – Scattering Rayleigh – Fluorescenza – Cenni di Spettroscopia – Spettri e Stokes shift - Struttura molecolare roto-vibrazionale – Scattering Raman – Fosforescenza – Intersystem crossing e Photo-bleaching
Microscopia
4. Il microscopio ottico (3 ore) – Componenti di un microscopio ottico – Epi e trans-illuminazione – sorgenti – condensatori – Illuminazione critica e illuminazione Koehler – Rivelazione – Obiettivo, tube lens, oculari – Apertura numerica, risoluzione e profondità di campo – microscopia in fluorescenza – telecamere.
5. Microscopia a scansione laser confocale (3 ore) – Assorbimento – Emissione spontanea – Emissione stimolata – Principio del Laser – Ottica del laser scanning – Laser scanning vs wide field – Microscopio confocale – Risoluzione spaziale – Sezionamento ottico – Sistemi di scansione (Disco di Nipkow – Specchi galvanometrici – Deflettori acusto-ottici – Specchi poligonali) – Rivelatori (fotodiodi – APD- fotomoltiplicatori) – Spectral imaging – Spectral unmixing
6. Applicazioni biologiche della microscopia in fluorescenza (3 ore) - Immuno labeling –Preparazione campioni – Selezione anticorpi e fluorofori – Coloranti organici compartimento specifici – Selezione filtri - Genetic labeling – Proteine fluorescenti: GFP e varianti
7. Microscopia in fluorescenza (TIRFM – FLIM - FRET) (3 ore) – Rifrazione e Riflessione interna totale – Onda evanescente - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (principi base) – Schema ottico per la TIRFM – Applicazioni biologiche della TIRFM – Fluorescenza e Vita Media – Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy – FLIM nel dominio dei tempi – FLIM nel dominio delle frequenze – FRET (Foster Resonance Energy Transfer) – Accettore e Donatore – Interazione molecolare e trasferimento di energia – Efficienza e raggio di Foster – Quenching del donatore
8. Microscopia a due fotoni (3 ore) – Microscopia lineare e Microscopia non-lineare – Fluorescenza a due fotoni - Confronto con la microscopia Confocale – Risoluzione – Profondità di penetrazione – Sorgenti laser impulsate – Tessuti e fluorofori endogeni – Descanning e Non-descanning – Microscopia in Seconda-armonica – Somma coerente – Emissione angolare – Sorgenti endogene di SHG – Scansione in polarizzazione
9. Optical manipulation #1 (2 ore) – Meccanica dei sistemi biologici: rivelazione, regolazione e adattamento dei sistemi biologici a stimoli meccanici – Meccanotrasduzione – Esempi di meccanica dei sistemi biologici: motori molecolari, muscolo, orecchio, cellule staminali – Forze in biologia – diffusione – Dinamica delle molecole biologiche in cellula – Meccanismi molecolari di regolazione meccanica.
10. Optical manipulation #2 (2 ore) – Pinzette ottiche (optical tweezers) – Forze negli optical tweezers – Rivelazione di movimento – Calibrazione – Configurazioni di misura di forza e spostamento su singole moelcole biologiche con optical tweezers: single-trap, double-trap, and three-bead assay – misura di forza e passo di singoli motori molecolari – proprietà meccaniche del DNA – Force-clamp
11. Optical manipulation #3 (2 ore) – Risoluzione spaziale negli optical tweezers – Rumore termico e strumentale – Risoluzione temporale negli optical tweezers – tempo di rilassamento – tempo morto – ultra-fast force-clamp
12. Microscopia Vibrazionale (3 ore) – Struttura molecolare – Scattering Rayleigh vs Scattering Raman – Spettroscopia Raman - Fingerprint molecolare - Micro-spettroscopia Raman – Clustering – Applicazioni – Coherent Antistokes Raman Scattering (CARS) microscopy – Principi del CARS – Sorgenti al ps – Detuning – Applicazioni – Imaging di lipidi – Imaging non-lineare multimodale – Schema ottico e limitazioni – Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy – Pump & Stokes – Modulazione e lock-in - Applicazioni
13. Microscopia di singola molecola (3 ore) – Limite di diffrazione – Risoluzione e Point Spread Function (PSF) – Localizzazione di singole molecole biologiche (FIONA) – Colocalizzazione (SHREC) – Single Particle Tracking (SPT) – Mean square displacement (MSD) – SHRIMP – Combinazione di localizzazione e manipolazione di singola molecola – localizzazione 3D
14. Super-risoluzione ottica (3 ore) – Metodi di super-risoluzione basati sulla localizzazione di singole molecole: PALM e STORM – Metodi di super-risoluzione deplition-based: STED e RESOLFT – Super-risoluzione 3D – applicazioni biologiche