Tecniche per l'espressione di proteine ricombinanti in sistemi batterici. Le esercitazioni di laboratorio saranno volte alla produzione di due proteine arricchite isotopicamente. Saranno poi effettuate alcune esercitazioni per la caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina e proteina-metallo tramite calorimetria, CD e NMR. Le informazioni ottenute saranno successivamente utilizzate per ottenere il modello molecolare dell'addotto proteina-proteina tramite approcci computazionali
Non esistono testi di riferimento specifici.
Saranno forniti a lezione capitoli di libri e review article sui soggetti trattati.
Obiettivi Formativi
Conoscenze:
Conoscenza teoriche e pratiche delle principali tecniche di biologia molecolare per l' espressione e la purificazione di proteine ricombinanti in sistemi batterici. Conoscenze sulle tecniche di espressione di proteine isotopicamente marcate. Conoscenze delle principali tecniche utilizzate per la caratterizzazione dell'interazione proteina-ione metallico, proteina-piccola molecola, proteina-proteina. Conoscenza dei principali programmi computazionali per il docking molecolare.
Comprensione:
Gli studenti saranno in grado di comprendere un protocollo di laboratorio e metterlo in pratica e di progettare e realizzare un protocollo per la catatterizzazione dell’interazione proteina-proteina. Gli studenti saranno in grado di comprendere le principali criticità che accompagnano la produzione di proteine ricombinanti.
Capacità acquisite
Gli studenti alla fine del corso sapranno analizzare spettri elettronici, sprettri di dicroismo circolare e semplici spettri di risonanza magnetica. Sapranno applicare le conoscenze acquisite a problemi reali, in laboratorio o durante una simulazione di interazione proteina-proteina
Presentazioni power point delle lezioni. Affiancamento in laboratorio durante le esercitazioni
Altre Informazioni
Frequenza delle lezioni ed esercitazioni:
la frequenza alle esercitazioni di laboratorio e’ obbligatoria
Modalità di verifica apprendimento
Prova orale. L’elenco delle date degli esami è accessibile al sito https://sol.unifi.it/docprenot/docprenot
Programma del corso
Tecniche di over-espressione di proteine ricombinanti in organismi batterici: vettori di espressione, strategie per incrementare la quantità di proteina espressa, ceppi cellulari, promotori, induzione dell’espressione, proteine di fusione. Espressione cell-free. Produzione di proteine di membrana e di proteine per l’ottimizzazione delle produzione di vaccini. Arricchimento isotopico di proteine ricombinanti. Tecniche di marcatura isotopica uniforme e selettiva. Modificazioni post-traduzionali di proteine. Metalloproteine e cenni sull’omeostasi dei metalli. Caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina o proteina-piccola molecola o proteina-ione metallico. Programmi di docking per la caratterizzazione in silico dell’interazione proteina-proteina.
Laboratorio: produzione e purificazione di due proteine ricombinanti. Esperienza di calorimetria (ITC); esperienza di dicroismo circolare su proteine contententi cluster Fe-S. Acquisizione di spettri NMR per la caratterizzata dell'interazione proteina-metallo e proteina-proteina. In particolare l'esercitazione prevede l'acquisizione ed analisi degli esperimenti NMR acquisiti sulle proteine prodotte in laboratorio e mappatura delle variazioni dei chemical shifts sulla loro struttura 3D. I dati ottenuti verrano utilizzati come input in programmi di docking