Il corso prevede attività di didattica frontale (4 cfu) e di laboratorio (2 cfu). Argomenti: struttura delle proteine e fold proteici. Proteostasi, IDP. Folding e misfolding delle proteine. Metodi di studio della struttura delle proteine. Software per analisi di strutture. Gli enzimi. Cinetica di Michaelis-Menten; inibizione. Meccanismo d'azione degli enzimi. Stato prestazionario. Regolazione enzimatica. Mutagenesi per l’analisi di enzimi. Plot di Scatchard. Cristallografia in enzimologia.
A. Fersht
STRUTTURA E MECCANISMI D’AZIONE DEGLI ENZIMI.
Zanichelli
Come funzionano le proteine
di Mike Williamson Bolognesi M. Zanichelli, 2013
Obiettivi Formativi
Scopo del corso è fornire agli studenti le basi teoriche e pratiche per lo studio della struttura delle proteine e della catalisi enzimatica; comprendere le relazioni struttura-funzione; analizzare i meccanismi di regolazione e la flessibilità conformazionale delle proteine; predire e analizzare le proprietà strutturali e funzionali di proteine ed enzimi. Tutto questo si articolerà integrando lezioni teoriche con esercitazioni in laboratorio.
Prerequisiti
Corsi vincolanti: Nessuno
E’ richiesta una conoscenza della biochimica di base
Metodi Didattici
Lezioni frontali per 32 ore (4 cfu) e 24 ore di lezioni di laboratorio (2 cfu), suddivise in 12 teoriche e 12 pratiche.
Altre Informazioni
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Modalità di verifica apprendimento
Esame orale + discussione dei risultati ottenuti durante le prove di laboratorio
Programma del corso
LEZIONE FRONTALI (4 cfu)
Richiami sulla struttura secondaria delle proteine: Eliche alfa, 3.10 e pi, foglietti beta, regioni loop e struttura a turn. Eliche di poliprolina.
Struttura supersecondaria. Diagrammi topologici, motivi elica-giro-elica, forcine beta, motivo a chiave greca, motivo beta-alfa-beta.
Uso dei software per lo studio della struttura delle molecole biologiche. Introduzione a pyMOL. Banche dati per strutture di proteine e domini. Predizione di strutture proteiche.
I domini proteici: funzioni biologiche e proprietà.
Proteine ad alfa elica: contatti tra eliche e struttura di proteine ad alfa-elica, fascio di quattro eliche, il folding delle globine.
Proteine alfa-beta: struttura a botte TIM, ripiegamento di Rossmann.
Proteine beta: proteine barile; motivo a chiave greca; "jelly roll".
Proteine estremofile: adattamenti strutturali nelle proteine termofile, alofile, ipertermofile, psicrofile, piezofile.
Folding e misfolding delle proteine: Ripiegamento in vitro e in vivo. Misfolding; stati conformazionali propensi ad aggregare. Proteostasi. Aggregazione proteica e malattie da misfolding.
Tecniche per lo studio della struttura delle proteine: assorbimento e fluorescenza, dicroismo circolare; risonanza magnetica nucleare; cristallografia a raggi-X; cryo-EM. Apparecchi per il mescolamento rapido.
Gli enzimi: caratteristiche generali. Coenzimi e cofattori e vitamine. Il sito attivo. Classificazione degli enzimi. La termodinamica delle reazioni enzimatiche. Spontaneità di una reazione. Grafico energetico di una reazione catalizzata da un enzima. Energia di attivazione (Ea). Equazione di Arrhenius. Relazione tra Ea e velocità di una reazione enzimatica. La cinetica enzimatica. La velocità iniziale. Condizioni di rapido equilibrio. Equazione di Michaelis-Menten. Significato dei principali parametri cinetici Km e Vmax e kcat. Il grafico dei doppi reciproci. Effetto del pH sulle reazioni catalizzate da un enzima. Gruppi ionizzabili negli enzimi: loro titolazione. Il pKa dei residui catalitici. Esempi pratici. Modello di Dixon Inibitori ed inibizione. Inibizione Competitiva, non competitiva, acompetitiva e mista. Inibizione parziale: metodi cinetici per l'individuazione di un inibitore parziale. L'inibizione irreversibile. Esempi di inibizione irreversibile. Marcatori di affinità. Utilizzo dei marcatori di affinità per la mappatura dei residui catalitici di un enzima. Tipi di catalisi. Esempi di meccanismo d'azione degli enzimi: esempi pratici. La cinetica di stato prestazionario. Individuazione di un intermedio cinetico. Regolazione dell'attività enzimatica. Controllo su sintesi e degradazione. Modificazioni covalenti. Attivazione proteolitica. Allosterismo: principi e modelli cinetici. Studio del meccanismo catalitico di un enzima mediante mutagenesi. Analisi strutturali e cinetiche di enzimi mutati. Dominanti negativi ed individuazione dei substrati fisiologici di un enzima. Plot di Scatchard. La cristallografia in enzimologia
LABORATORIO (2 cfu)
Spettri di fluorescenza di una proteina nativa e di una proteina denaturata; spettri in dicroismo circolare di proteine contenenti vari tipi di struttura; Light scattering dinamico di monomeri e aggregati. Dosaggi di attività enzimatica; determinazione della Km di un enzima; determinazione della Ki di un inibitore enzimatico.