Preparazione dei campioni. Spettrofotometria, Spettrofluorimetria. Tecniche immunologiche. L’enzimologia diagnostica.
Cromatografia: principi, resine, cr. di partizione, HPLC, GC; cromatografia di affinità. Espressione di proteine ricombinanti. Elettroforesi (SDS-PAGE, IEF, 2D-EF, western blot). Spettrometria di massa di metaboliti e proteine. Principi, strumentazione, tecniche di proteomica (sistematica, differenziale, funzionale) e metabolomica.
Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche. di K. Wilson and J. Walker. Raffaello cortina editore
Metodologie biochimiche. Bonaccorsi et al, Zanichelli ED.
Reed & Holmes Metodologie di base per le scienze molecolari Zanichelli Ed.
Obiettivi Formativi
Preparazione campioni, estrazione, purificazione. Fotometria e fluorimetria. Dosaggio di enzimi e metaboliti. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti e per lo studio delle proteine. Principi e basi tecniche per dosaggi enzimatici e di metaboliti nella pratica del laboratorio di biochimica. I dosaggi immunologici per la determinazione di ormoni, antigeni, metaboliti. Principali tecniche legate alla proteomica (elettroforesi e cromatografia bidimensionale, spettrometria di massa) . principi e applicazioni di proteomica differenziale e funzionale.
Il corso si svolge prevalentemente mediante lezioni frontali. Sono comunque previste esercitazioni pratiche relative a: dosaggi enzimatici e immunologici; western blot, Cromatografia in HPLC e FPLC, Spettrometria di massa . Expressione proteine ricombinanti.
Altre Informazioni
Il corso è diviso in una parte principale (4CFU) riguardante le principali tecniche impiegate nel laboratorio di biochimica e in una parte (2CFU) in cui vengono affrontate tematiche legate alla biochimica clinica le cui tecniche di analisi sono state analizzate nella prima parte del corso.
Modalità di verifica apprendimento
Prova orale riguardante gli argomenti del corso. Lo studente dovrà conoscere le tecniche impiegate in laboratorio anche in riferimento alle esperienze pratiche fatte durante la tesi triennale e/o lo svolgimento di periodo di tirocinio.
Programma del corso
Principi di centrifugazione
Tecniche preparative e analitiche. Il coefficiente di sedimentazione, i g e gli rpm. Tipi di rotori. La centrifugazione in gradiente di densità.
Tecniche spettroscopiche
Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile: strumentazioni, applicazioni (dosaggio delle proteine), La tecnica del Dicroismo circolare. Basi per l'utilizzazione di raggi X e Risonanza magnetica per lo studio delle proteine.
Spettrofluorimetria e chemioluminescenza: principi, strumentazione, applicazioni (l’uso di sonde fluorescenti la GFP, altri fluorofori sintetici, il microscopio a fluorescenza).
Metodi nel laboratorio di biochimica:
Metodi enzimatici per la determinazione quantitativa di enzimi e metaboliti. Proncipi del metodo: richiami alla cinetica enzimatica, metodo cinetico e metodo a termine. Calcolo delle U/mL e mg/mL. Uso di substrati sintetici e di reazioni accoppiate.
Esempi: dosaggio di transaminasi, creatin chinasi, deidrogenasi, glucosio, colesterolo, trigliceridi, creatinina.
I metodi immuno-enzimatici: RIA, IRMA ELISA, metodi in chemioluminescenza e in fluorescenza. Specificità e sensibilità della tecnica. Esempi: dosaggio di ormoni tiroidei, dosaggio di PTH, di citokine, dosaggio di Ab per il monitoraggio di malattie, dosaggio di marker tumorali.
PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE
principi di chimica delle proteine: lisi dei tessuti, precipitazioni frazionate, salting out, filtrazione, dialisi. Scelta del metodo specifico di dosaggio
Proteine ricombinanti.
Clonazione e espressione di proteine in sistemi eterologhi (batteri, lieviti, cellule eucariote); strategie di produzione e purificazione. Caratterizzazione struttura/funzione di proteine ricombinanti. Cromatografia, elettroforesi e spettrometria di massa negli studi proteomici.
Definizione e scopo della proteomica. La proteomica sistematica, funzionale e differenziale.
Tecniche cromatografiche:
Principi: coefficiente di partizione, numero di piatti teorici. Strumentazione. La cromatografia ad alta risoluzione (HPLC e GC): strumentazione e vantaggi. Cromatografia di adsorbimento, partizione, gel filtrazione, scambio ionico e affinità: fasi stazionarie, sistemi di eluizione, applicazioni. Tecniche avanzate in cromatografia di partizione (RP-HPLC) e affinità (cromatografia di immunoaffinità e tecniche correlate)
Metodi elettroforetici. Polimerizzazione di agarosio e poliacrilamide, preparazione di campioni, SDS-PAGE., Western blotting, immunoblotting, stripping, analisi immagine. Isoelettro-focalizzazione: con agarosio e anfoliti, con immobiline. Elettroforesi bidimensionale: strumentazione. Applicazioni: il progetto proteoma.
Spettrometria di massa:
Sensibilità e specificità Le sorgenti: ad urto elettronico (produzione di M+ e ioni frammento) applicazioni). Le sorgenti a ionizzazione “soft”: la sorgente FAB, la sorgente MALDI (la produzione di M+H+); la sorgente ESI (produzione di ioni multicarica). Analizzatori: a settore magnetico ed elettrico, quadrupolo, esapolo, trappola ionica, l’analizzatore FT-MS, l’analizzatore a tempo di volo. L’accoppiamento Gas-Cromatografia-Spettrometria di Massa. Gli strumenti MALDI/TOF, nano-HPLC-ESI Lo spettrometro MS/MS per la determinazione della sequenza dei peptidi. Altre tecniche di proteomica:
la tecnica SELDI, le tecniche ICAT e DIGE per la proteomica differenziale. Principali tecniche di proteomica funzionale (modificazioni postraduzionali, interazioni proteina proteina, pull-down assay e il two hybrid system)
Nozioni di Biochimica Clinica: Marcatori di flogosi, Enzimologia clinica (enzimi, isoenzimi, marker di infarto, marker di danno epatico). Composti azotati non proteici, Proteine plasmatiche, proteinurie.