Il modello sperimentale animale e in vitro. Generazione di anticorpi monoclonali per mediante il le tecnologie del DNa ricombinante. Nuove strategie vaccinali. Le "omiche": proteomica, genomica, trascrittomica, metagenomica e metabolomica. Metodiche per la manipolazione dell'espressione genica. Terapia genica. Editing del DNA. Tecniche di sequenziamento di DNA mediante NGS.
Come base generale, Biologia molecolare della cellula di Alberts e al., ed Zanichelli, o qualunque altro buon testo di biologia molecolare e cellulare. A causa della natura innovativa della materia trattata, il corso viene continuamente aggiornato con materiale didattico fornito dal docente.
Obiettivi Formativi
Acquisizione della conoscenza delle tecniche piu' avanzate di studio della biologia cellulare e molecolare di base, con finalita' di applicazione nella medicina traslazionale.
Prerequisiti
Diploma di Laurea Triennale, col conseguimento di buone basi di biochimica, genetica, biologia molecolare e fisiologia cellulare.
Metodi Didattici
Lezioni frontali ed esperienze pratiche di laboratorio.
Modalità di verifica apprendimento
Esame orale di fine corso
Programma del corso
Il metodo scientifico. I modelli animali nella sperimentazione. Le colture cellulari di cellule di mammifero da tessuti solidi e liquidi. Lo studio dell'angiogenesi: modelli in vitro ed in vivo. Il ruolo del TME nel cancro. Esempi di modelli di topo umanizzati e loro applicazioni in ambito oncologico e farmacodinamico: BRGSF-a2-HIS e BLTS. Modelli di staminalita' naturali e artificiali: ESC, PSC, iPSC. Modelli di colture cellulari 3D. Differenze tra staminali embrionali, da tessuto adulto e indotte. I fattori di Yamanaka. Applicazioni degli organoidi nella medicina personalizzata.Applicazioni delle colture 3D nello studio del metabolismo tumorale, della risposta alle terapie antitumorali e della determinazione delle staminali del cancro: le tumor-sfere da coltura e da paziente. Prospettive per la biostampa 3D. Generalità sui meccanismi della risposta immunitaria cellulo-mediata. Ottimizzazione delle tecniche di immunizzazione per l'ottenimento di anticorpi diretti contro antigeni specifici per le applicazioni in biologia cellulare. GLe nuove strategie vaccinali: il paradigma del COVID19. Generazioni di anticorpi mono- e policlonali. I monoclonali nella terapia antitumorale: esempi. Generazione di anticorpi monoclonali umanizzati mediante la tecnica del phage display e del DNA ricombinante. Applicazione degli anticorpi in biologia cellulare: il western blotting; l'immunofluorescenza per il cell sorting. La microscopia confocale in fluorescenza. La immuno- e la co-immunoprecipitazione. La ChIP. Metodi alternativi alla immunofluorescenza per la determinazione di biomolecole: la falloidina coniugata e gli intercalanti delle basi del DNA. Esempi di analisi di immagini in immunofluorescenza ottenute mediante microscopia confocale. La proteomica: elettroforesi bidimensionale e tecniche di SM. Il sistema BLAST nella determinazione delle EST. Principi del DNA ricombinante. Enzimi e vettori. Moduli dei vettori necessari per il clonaggio di un gene. Linkers e adattameri. Vettori per l'espressione di geni in cellule di mammifero: vettori plasmidici, retrovirali (lentivirali), e adenovirali. Pseudotipizzazione dell'envelope. Packaging di virus ricombinanti. La lipofezione. Le genoteche: differenze tra genoteche di espressione e genoteche genomiche. Costruzione di una genoteca genomica. Allineamento dei CONTIG e sequenziamento. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (es. piattaforma ILLUMINA). Generalita' sulle biobanche e sugli strumenti di elaborazione dei dati bioinformatici.Lo studio del trascrittoma. Costruzione di una genoteca di espressione: purificazione dell'mRNA, retrotrascrizione ed adattamento dei cDNA per il clonaggio in un plasmide. Preparazione del genoma e del trascrittoma per il sequenziamento mediante NGS. Sequenziamento da singola cellula. Il BARcoding del DNA. La ChIP-seq.Il doppio ibrido nel lievito. Analisi del trascrittoma: la RT-PCR real time e l'RNA-seq. Il genoma nascosto: storia della scoperta dell'RNAi. Basi molecolari e significato dell'RNAi. Differenza regolativa tra siRNA e miRNA. Tecniche per l'introduzione e l'espressione di RNA interferenti in cellule di mammifero. Applicazioni sperimentali dell'RNAi nel silenziamento dell'espressione genica. Gli lncRNA: struttura e funzioni. La ChIRP. La CLIP. La transgenesi animale. La ghiandola mammaria come bioreattore animale. I promotori tessuto-specifici. Tecniche per la transgenesi animale: metodo della microiniezione nel nucleo; metodo della manipolazione delle staminali embrionali. Il topo ingegnerizzato come modello sperimentale per lo studio di patologie umane.Il knock-in e il knock-out genico mediante gene targeting. Il clonaggio posizionale nella determinazione dei geni correlati a patologie su base ereditaria. Determinazione di alleli polimorfici. Uso dei polimorfismi STR per il mappaggio genico. Validazione della correlazione tra patologia e mutazioni nel gene identificato.Le NGS nello screening delle mutazioni associate a coorti di studio e nella generazione di biobanche informatiche. Il paradigma del Cancer Genome Atlas (TCGA). La terapia genica per ripristino genico mediante vettori virali ricombinanti. La terapia genica correttiva: la scoperta dei sistemi CRISPR nei batteri e lo sviluppo del sistema di editing CRISPR/CAS9.
Esercitazione in laboratorio: estrazione di DNA da cellule in coltura. Microscopia a fluorescenza ad alta definizizione. Marcatura di cellule mediante sonde e/o anticorpi coniugati a fluorofori e/o intercalanti del DNA. Marcatura con falloidina rodaminata. Osservazione, acquisizione e analisi di immagini in immunofluorescenza per l'osservazione di fenomeni biologici (es: apoptosi; EMT; traslocazioni subcellulari di proteine, analisi del citoscheletro, ecc)