Al termine del corso lo studente avrà acquisito conoscenze di:
Tecniche spettroscopiche associate allo studio di proteine ed enzimi.
Tecniche di dosaggio di enzimi, metaboliti, ormoni.
Tecniche separative e legate alla proteomica
Tecniche cromatografiche: partizione, scambi ionico, affinità e strumentazione associata.
Tecniche elettroforetiche di proteine (IEF e SDS_PAGE). Western Blot.
Spettrometria di massa e principali applicazioni.
Biochimica clinica: metodi analitici di marker patologici
Bonaccorsi di Patti et al, Metodologie Biochimiche. Zanichelli Ed
Maccarrone M. Metodologie Biochimiche e biomolecolari. Zanichelli Ed.
Obiettivi Formativi
Permettere l'acquisizione di conoscenza delle tecniche di base in modo da poter apprendere con spirito critico i più recenti avanzamenti delle nuove metodologie legate alla biochimica
Prerequisiti
Per una proficua frequenza del corso è necessario avere le conoscenze di base di:
Biochimica, Biologia molecolare, tecniche di base di laboratorio,.
Metodi Didattici
CFU= 6
ore totali del corso 150 (6x25h)
Numero di ore per studio personale e altre attività formative di tipo individuale: 90
Numero di ore relative alle attività in aula: 40
Numero di ore relative ad attività di laboratorio: 8
Numero di ore relative ad attività seminariali: 4
Altre Informazioni
Frequenza delle lezioni ed esercitazioni: fortemente consigliata.
Strumenti a supporto della didattica
Inserimento su Moodle dei lucidi proiettati
Orario di ricevimento:
verrà comunicato un giorno all'inizio del corso. Si potranno comunque concordare appuntamenti previo contatto mail (luigia.pazzagli@unifi.it)
Modalità di verifica apprendimento
l'esame finale sarà orale. La valutazione terrà conto della capacità di illustrare i principi e le teorie appresi con un discorso organico; capacità di
ragionamento critico sullo studio realizzato; completezza nell’affrontare le tematiche trattate;
competenza nell’impiego del lessico specialistico.
Programma del corso
Principi di centrifugazione
Tecniche preparative e analitiche. Il coefficiente di sedimentazione, i g e gli rpm. Tipi di rotori. La centrifugazione in gradiente di densità.
Tecniche spettroscopiche
Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile: strumentazioni, applicazioni (dosaggio delle proteine), La tecnica del Dicroismo circolare. Basi per l'utilizzazione di raggi X e Risonanza magnetica per lo studio delle proteine.
Spettrofluorimetria e chemioluminescenza: principi, strumentazione, applicazioni (l’uso di sonde fluorescenti la GFP, altri fluorofori sintetici, il microscopio a fluorescenza).
Metodi nel laboratorio di biochimica:
Metodi enzimatici per la determinazione quantitativa di enzimi e metaboliti. Proncipi del metodo: richiami alla cinetica enzimatica, metodo cinetico e metodo a termine. Calcolo delle U/mL e mg/mL. Uso di substrati sintetici e di reazioni accoppiate.
Esempi: dosaggio di transaminasi, creatin chinasi, deidrogenasi, glucosio, colesterolo, trigliceridi, creatinina.
I metodi immuno-enzimatici: RIA, IRMA ELISA, metodi in chemioluminescenza e in fluorescenza. Specificità e sensibilità della tecnica. Esempi: dosaggio di ormoni tiroidei, dosaggio di PTH, di citokine, dosaggio di Ab per il monitoraggio di malattie, dosaggio di marker tumorali.
PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE
principi di chimica delle proteine: lisi dei tessuti, precipitazioni frazionate, salting out, filtrazione, dialisi. Scelta del metodo specifico di dosaggio
Proteine ricombinanti.
Clonazione e espressione di proteine in sistemi eterologhi (batteri, lieviti, cellule eucariote); strategie di produzione e purificazione. Caratterizzazione struttura/funzione di proteine ricombinanti.
Cromatografia, elettroforesi e spettrometria di massa negli studi proteomici.
Definizione e scopo della proteomica. La proteomica sistematica, funzionale e differenziale.
Tecniche cromatografiche:
Principi: coefficiente di partizione, numero di piatti teorici. Strumentazione. La cromatografia ad alta risoluzione (HPLC e GC): strumentazione e vantaggi. Cromatografia di adsorbimento, partizione, gel filtrazione, scambio ionico e affinità: fasi stazionarie, sistemi di eluizione, applicazioni. Tecniche avanzate in cromatografia di partizione (RP-HPLC) e affinità (cromatografia di immunoaffinità e tecniche correlate)
Metodi elettroforetici. Polimerizzazione di agarosio e poliacrilamide, preparazione di campioni, SDS-PAGE., Western blotting, immunoblotting, stripping, analisi immagine. Isoelettro-focalizzazione: con agarosio e anfoliti, con immobiline. Elettroforesi bidimensionale: strumentazione. Applicazioni: il progetto proteoma.
Spettrometria di massa:
Sensibilità e specificità Le sorgenti: ad urto elettronico (produzione di M+ e ioni frammento) applicazioni). Le sorgenti a ionizzazione “soft”: la sorgente FAB, la sorgente MALDI (la produzione di M+H+); la sorgente ESI (produzione di ioni multicarica). Analizzatori: a settore magnetico ed elettrico, quadrupolo, esapolo, trappola ionica, l’analizzatore FT-MS, l’analizzatore a tempo di volo. L’accoppiamento Gas-Cromatografia-Spettrometria di Massa. Gli strumenti MALDI/TOF, nano-HPLC-ESI Lo spettrometro MS/MS per la determinazione della sequenza dei peptidi.
Altre tecniche di proteomica:
la tecnica SELDI, le tecniche ICAT e DIGE per la proteomica differenziale. Principali tecniche di proteomica funzionale (modificazioni postraduzionali, interazioni proteina proteina, pull-down assay e il two hybrid system).
ELEMENTI DI BIOCHIMICA CLINICA: le principali applicazioni metodologiche saranno affrontate anche dal punto di vista delle applicazioni cliniche: profilo infiammatorio, enzimologia clinica , composti azotati non proteici, proteine plasmatiche, proteinurie.