Trattandosi di un corso posizionato al termine del percorso curriculare, lo scopo e' quello di spaziare in tutti gli ambiti biologici, in particolare in quelli che riguardano la salute umana, al fine di identificare gli strumenti tecnologici e i percorsi scientifici in grado di ampliare la conoscenza attraverso il raggiungimento di scoperte innovative. Pertanto persegue il raggiungimento dei seguenti obiettivi formativi:
Conoscenza e comprensione;
Capacità di applicare conoscenza e comprensione;
Autonomia di giudizio;
Abilità comunicative;
Capacità di apprendimento
Prerequisiti
Conoscenza di biochimica, biologia cellulare e molecolare
Metodi Didattici
Lezioni frontali ed esercitazioni in laboratorio a frequenza obbligatoria
Altre Informazioni
Le date delle esercitazioni verranno concordate all'inizio del corso e si svolgeranno su quattro pomeriggi
Modalità di verifica apprendimento
Esame orale
Programma del corso
Il metodo scientifico. Panoramica dei modelli sperimentali animali. I modelli animali nella sperimentazione del cancro umano: lo zebrafish. Il topo nudo e NOD-SCID. I modelli PDX. Modelli di colture cellulari 3D. Differenze tra staminali embrionali, da tessuto adulto e indotte. I fattori di Yamanaka. Applicazioni degli organoidi nella medicina personalizzata. Le colture cellulari di cellule di mammifero da tessuti solidi e liquidi. Lo studio dell'angiogenesi: modelli in vitro ed in vivo. Il ruolo del TME nel cancro. Esempi di modelli di topo umanizzati e loro applicazioni in ambito oncologico e farmacodinamico: BRGSF-a2-HIS e BLTS. Modelli di staminalita' naturali e artificiali: ESC, PSC, iPSC. Applicazioni delle colture 3D nello studio del metabolismo tumorale, nella risposta alle terapie antitumorali e nella determinazione delle staminali del cancro: le tumor-sfere da coltura e da paziente. Prospettive per la biostampa 3D. Generalità sui meccanismi della risposta immunitaria cellulo-mediata. Ottimizzazione delle tecniche di immunizzazione per l'ottenimento di anticorpi diretti contro antigeni specifici per le applicazioni in biologia cellulare. Generazioni di anticorpi mono- e policlonali. I monoclonali nella terapia antitumorale: esempi. Generazione di anticorpi monoclonali umanizzati mediante la tecnica del phage display e del DNA ricombinante. L'approccio immunoterapico nel cancro umano. Gli inibitori dei checkpoint immunitari e le CAR-T.Applicazione degli anticorpi in biologia cellulare: il western blotting; l'immunofluorescenza per il cell sorting. La microscopia confocale in fluorescenza. La immuno- e la co-immunoprecipitazione. La ChIP. Metodi alternativi alla immunofluorescenza per la determinazione di biomolecole: la falloidina coniugata e gli intercalanti delle basi del DNA. Esempi di analisi di immagini in immunofluorescenza ottenute mediante microscopia confocale.La proteomica: elettroforesi bidimensionale e tecniche di SM. Il sistema BLAST nella determinazione delle EST. Principi del DNA ricombinante. Enzimi e vettori. Moduli dei vettori necessari per il clonaggio di un gene. Linkers e adattameri. Vettori per l'espressione di geni in cellule di mammifero: vettori plasmidici, retrovirali (lentivirali), e adenovirali. Pseudotipizzazione dell'envelope. Packaging di virus ricombinanti. La lipofezione. Differenze tra genoteche di espressione e genoteche genomiche. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (es. piattaforma ILLUMINA). Generalita' sulle biobanche e sugli strumenti di elaborazione dei dati bioinformatici. Lo studio del trascrittoma. Purificazione dell'mRNA, e retrotrascrizione. La RT-PCR-Real time. Preparazione del del trascrittoma per il sequenziamento mediante NGS. Sequenziamento da singola cellula. Il BARcoding del DNA. La ChIP-seq. Il doppio ibrido nel lievito. Il genoma nascosto: storia della scoperta dell'RNAi. Basi molecolari e significato dell'RNAi. Differenza regolativa tra siRNA e miRNA. Tecniche per l'introduzione e l'espressione di RNA interferenti in cellule di mammifero. Applicazioni sperimentali dell'RNAi nel silenziamento dell'espressione genica. Gli lncRNA: struttura e funzioni. La ChIRP. La CLIP. La transgenesi animale. La ghiandola mammaria come bioreattore animale. I promotori tessuto-specifici. Tecniche per la transgenesi animale: metodo della microiniezione nel nucleo; metodo della manipolazione delle staminali embrionali. Il topo ingegnerizzato come modello sperimentale per lo studio di patologie umane. Il knock-in e il knock-out genico mediante gene targeting. Il clonaggio posizionale nella determinazione dei geni correlati a patologie su base ereditaria. Determinazione di alleli polimorfici. Uso dei polimorfismi STR per il mappaggio genico. Validazione della correlazione tra patologia e mutazioni nel gene identificato. Le NGS nello screening delle mutazioni associate a coorti di studio e nella generazione di biobanche informatiche. Il paradigma del Cancer Genome Atlas (TCGA). La terapia genica per ripristino genico mediante vettori virali ricombinanti. La terapia genica correttiva: la scoperta del sistema CRISPR nei batteri e lo sviluppo del sistema di editing CRISPR/CAS9
Esperienze di laboratorio: Estrazione di DNA genomico da cellule di mammifero. Preparazione di vetrini di cellule decorati per immunofluorescenza ed osservazione mediante microscopia confocale.