Principi di centrifugazione. Spettrofotometria, Spettrofluorimetria e chemioluminescenza, dicroismo circolare. Gli enzimi: cinetica allo stato stazionario e pre-stazionario. L’enzimologia diagnostica. Uso di anticorpi. Cromatografia: principi, resine, cr. di partizione, HPLC, GC; cromatografia di affinità. Espressione di proteine ricombinanti. Elettroforesi (SDS-PAGE, IEF, 2D-EF, western blot) spettrometria di massa di metaboliti e proteine. Principi di proteomica
Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche. di K. Wilson and J. Walker. Raffaello cortina editore
Metodologie di base per le scienze biomolecolari- R. Reed, D. Holmes, j. Weyers, A. Jones. Zanichelli editore
Obiettivi Formativi
Conoscenze: Preparazione campioni, estrazione, purificazione. Fotometria e fluorimetria. Dosaggio di enzimi e metaboliti. Dosaggi immunologici. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti e per lo studio delle proteine.
Competenze acquisite Il corso è indirizzato a far acquisire allo studente le capacità per scegliere l’adeguata metodica per la determinazione analitica e preparativa di proteine, enzimi, metaboliti, ormoni. Viene affrontata anche la valutazione critica dei risultati ottenuti.
Capacità acquisite al termine del corso: Gli studenti avranno la capacità di mettere a punto esperimenti di purificazione di proteine, dosaggi enzimatici, elettroforesi di DNA e proteine, tecniche di western blot.
Numero di ore totali del corso: 150 (= 6 x 25)
Numero di ore per studio personale e altre attività formative di tipo individuale:
Numero di ore relative alle attività in aula: 44
Numero di ore relative ad attività di laboratorio (lezioni in laboratorio): 16
Altre Informazioni
Frequenza delle lezioni ed esercitazioni: frequenza fortemente consigliata
Strumenti a supporto della didatticaLa strumentazione in dotazione presso il dipartimento di scienze biochimiche viene usata per effettuare lezioni dimostrative ed esercitazioni pratiche.
Orario di ricevimento:
Mercoledì ore 11-13 e ore 16-18 presso il Dipartimento di Scienze Biochimiche, Viale Morgagni 50.E’ possibile il ricevimento in altri orari previo appuntamento.
Programma del corso
Principi di baseUnità di misura, soluzioni tampone, elettrodi a pH. Misure biochimiche quantitative. Metodi di calibrazione, standard interni. Principi di centrifugazioneTecniche preparative e analitiche. Il coefficiente di sedimentazione, i g e gli rpm. Tipi di rotori. La centrifugazione in gradiente di densità. L’ultracentrifuga analitica. Tecniche spettroscopicheSpettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile: strumentazioni, applicazioni. Spettrofluorimetria e chemioluminescenza: principi, strumentazione, applicazioni (dosaggi immunologici, l’uso di sonde fluorescenti la GFP, altri fluorofori sinteticii, il microscopio a fluorescenza e confocale). Spettroscopia di dicroismo circolare: principi, strumentazione, applicazioni (struttura secondaria delle proteine e folding proteico). Spettroscopia nell’infrarosso: principi, applicazioni allo studio delle proteine. Il Dynamic Light Scattering nello studio delle dimensioni delle proteine e delle interazioni proteina-proteina.EnzimologiaLo studio degli enzimi: Cinetica allo stato stazionario: determinazione di Km e Vmax, analisi dei risultati per lo studio del meccanismo d’azione; inibizione enzimatica. Cinetica allo stato prestazionario: strumenti a flusso continuo e interrotto. Studio del legame recettore ligando: la Kd, metodi di studio.L’enzimologia diagnostica: dosaggio di enzimi e metaboliti nel laboratorio di chimica-clinica e nell’analisi degli alimenti.Tecniche immunologicheGli anticorpi come reagenti. Sistemi di marcatura di anticorpi con enzimi e isotopi radioattivi. Dosaggi di ormoni e metaboliti, immunoistochimica, microscopia in fluorescenza, immunoblot).Tecniche cromatografiche:Principi: coefficiente di partizione, numero di piatti teotici, altezza del piatto. Strumentazione. La cromatografia ad alta risoluzione (HPLC): strumentazione e vantaggi. Cromatografia di adsorbimento, partizione, gel filtrazione, scambio ionico e affinità: fasi stazionarie, sistemi di eluizione, applicazioni. Tecniche avanzate in cromatografia di partizione e affinità.Proteine ricombinanti.Clonazione e espressione di proteine in sistemi eterologhi (batteri, lieviti, cellule eucariote); strategie di produzione e purificazione. Caratterizzazione struttura/funzione di proteine ricombinanti. Metodi elettroforetici.Principi. Polimerizzazione di agarosio e poliacrilamide, preparazione di campioni, SDS-PAGE. Elettroeluizione, Western blotting, immunoblotting, stripping, analisi immagine. Isoelettro-focalizzazione: con agarosio e anfoliti, con immobiline. Elettroforesi bidimensionale: strumentazione. Applicazioni: il progetto proteoma. Elettroforesi capillare: strumentazione, il flusso elettroendoosmotico. Spettrometria di massa:Sensibilità e specificità Cos’è uno spettro di massa. Strumentazione. Peso molecolare monoisotopico e medio. Le sorgenti: ad urto elettronico (produzione di M+ e ioni frammento) applicazioni). Le sorgenti a ionizzazione “soft”: la sorgente FAB, la sorgente MALDI (il fascio laser, le matrici, la produzione di M+H+); la sorgente ESI (produzione di ioni multicarica). Analizzatori: a settore magnetico ed elettrico, quadrupolo, esapolo, trappola ionica, l’analizzatore FT-MS, l’analizzatore a tempo di volo. L’accoppiamento Gas-Cromatografia-Spettrometria di Massa. Gli strumenti MALDI/TOF, nano-HPLC-ESI nello studio delle proteine (applicazioni alla proteomica sistematica e differenziale). Lo spettrometro MS/MS per la determinazione della sequenza dei peptidi.