Preparazione dei campioni. Metodi di studio e caratteristiche strutture proteine. Spettrofotometria, Spettrofluorimetria e chemioluminescenza, dicroismo circolare. L’enzimologia diagnostica. Cromatografia: principi, resine, cr. di partizione, HPLC, GC; cromatografia di affinità. Espressione di proteine ricombinanti. Elettroforesi (SDS-PAGE, IEF, 2D-EF, western blot) spettrometria di massa di metaboliti e proteine. Principi e tecniche di proteomica (sistematica, differenziale, funzionale)
Libri di testo:
Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche. di K. Wilson and J. Walker. Raffaello cortina editore
Metodologie di base per le scienze biomolecolari- R. Reed, D. Holmes, j. Weyers, A. Jones. Zanichelli editore.
Obiettivi Formativi
Conoscenze:
Preparazione campioni, estrazione, purificazione. Fotometria e fluorimetria. Dosaggio di enzimi e metaboliti. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti e per lo studio delle proteine. Studio della struttura primaria, secondaria e terziaria. Principali tecniche legate alla proteomica (elettroforesi e cromatografia bidimensionale, spettrometria di massa)
Competenze acquisite
Il corso è indirizzato a far acquisire allo studente le capacità per scegliere l’adeguata metodica per la determinazione analitica e preparativa di proteine, enzimi, metaboliti, ormoni. Viene affrontata anche la valutazione critica dei risultati ottenuti. Valutazione dell’importanza e dei limiti degli studi proteomici.
Capacità acquisite al termine del corso:
Gli studenti avranno la capacità di mettere a punto esperimenti di purificazione di proteine, dosaggi enzimatici, elettroforesi di DNA e proteine, tecniche di western blot.
Tecniche di elettroforesi bidimensionale e preparazione di campioni.
CFU: 6
Numero di ore totali del corso: 150 (= 6 x 25)
Numero di ore per studio personale e altre attività formative di tipo individuale:
Numero di ore relative alle attività in aula: 44
Numero di ore relative ad attività di laboratorio (lezioni in laboratorio): 16
Numero di ore relative ad attività di esercitazioni (in laboratorio e in campo):
Numero di ore relative ad attività seminariali: 0
Numero di ore relative ad attività di stage: 0
Numero di ore per prove in itinere: 0
Altre Informazioni
Orario di ricevimento
Mercoledì ore 11-13 e ore 16-18 presso il Dipartimento di Scienze Biochimiche, Viale Morgagni 50.
E’ possibile il ricevimento in altri orari previo appuntamento.
Modalità di verifica apprendimento
Modalità: prova orale riguardante gli argomenti affrontati e esposizione di un lavoro a scelta dello studente
Programma del corso
Principi di base
Unità di misura, soluzioni tampone, elettrodi a pH. Misure biochimiche quantitative. Metodi di calibrazione, standard interni.
Caratteristiche chimico fisiche degli aminoacidi, strutture primarie, secondarie e terziarie.
Principi di centrifugazione
Tecniche preparative e analitiche. Il coefficiente di sedimentazione, i g e gli rpm. Tipi di rotori. La centrifugazione in gradiente di densità. L’ultracentrifuga analitica.
Tecniche spettroscopiche
Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile: strumentazioni, applicazioni (dosaggio delle proteine) Spettrofluorimetria e chemioluminescenza: principi, strumentazione, applicazioni (dosaggi immunologici, l’uso di sonde fluorescenti la GFP, altri fluorofori sintetici, il microscopio a fluorescenza e confocale). Spettroscopia di dicroismo circolare: principi, strumentazione, applicazioni (struttura secondaria delle proteine e folding proteico).
Risonanza magnetica nucleare e cristallografia ai raggi X: loro utilizzo nella determinazione della struttura tridimensionale delle proteine. Preparazione dei campioni da impiegare in queste ultime due tecniche.
Metodi predittivi nello studio delle proteine.
Proteine ricombinanti.
Clonazione e espressione di proteine in sistemi eterologhi (batteri, lieviti, cellule eucariote); strategie di produzione e purificazione. Caratterizzazione struttura/funzione di proteine ricombinanti.
Enzimologia
Lo studio degli enzimi: Cinetica allo stato stazionario: determinazione di Km e Vmax, analisi dei risultati per lo studio del meccanismo d’azione; inibizione enzimatica. Cinetica allo stato prestazionario: strumenti a flusso continuo e interrotto. Studio del legame recettore ligando: la Kd, metodi di studio.
L’enzimologia diagnostica: dosaggio di enzimi e metaboliti nel laboratorio di chimica-clinica e nell’analisi degli alimenti.
Cromatografia, elettroforesi e spettrometria di massa negli studi proteomici.
Definizione e scopo della proteomica. La proteomica sistematica, funzionale e differenziale.
Tecniche cromatografiche:
Principi: coefficiente di partizione, numero di piatti teotici, altezza del piatto. Strumentazione. La cromatografia ad alta risoluzione (HPLC): strumentazione e vantaggi. Cromatografia di adsorbimento, partizione, gel filtrazione, scambio ionico e affinità: fasi stazionarie, sistemi di eluizione, applicazioni.
Tecniche avanzate in cromatografia di partizione e affinità.
Metodi elettroforetici.
Principi. Polimerizzazione di agarosio e poliacrilamide, preparazione di campioni, SDS-PAGE., Western blotting, immunoblotting, stripping, analisi immagine. Isoelettro-focalizzazione: con agarosio e anfoliti, con immobiline. Elettroforesi bidimensionale: strumentazione. Applicazioni: il progetto proteoma.
Spettrometria di massa:
Sensibilità e specificità Cos’è uno spettro di massa. Strumentazione. Peso molecolare monoisotopico e medio. Le sorgenti: ad urto elettronico (produzione di M+ e ioni frammento) applicazioni). Le sorgenti a ionizzazione “soft”: la sorgente FAB, la sorgente MALDI (il fascio laser, le matrici, la produzione di M+H+); la sorgente ESI (produzione di ioni multicarica). Analizzatori: a settore magnetico ed elettrico, quadrupolo, esapolo, trappola ionica, l’analizzatore FT-MS, l’analizzatore a tempo di volo. L’accoppiamento Gas-Cromatografia-Spettrometria di Massa. Gli strumenti MALDI/TOF, nano-HPLC-ESI Lo spettrometro MS/MS per la determinazione della sequenza dei peptidi.
Atre tecniche di proteomica:
la tecnica SELDI, le tecniche ICAT e DIGE per la proteomica differenziale. Principali tecniche di proteomica funzionale (modificazioni postraduzionali, interazioni proteina proteina, pull-down assay e il two hybrid system)