Libri di testo:
J. Mertz – “Introduction to Optical Microscopy” – Roberts & co. publisher
Tutorial Online:
- http://www.microscopyu.com/
- http://www.olympusmicro.com/primer/
Obiettivi Formativi
Conoscenze:
Principi di ottica applicata alla biologia
Tecniche microscopiche tradizionali (Campo largo – Fluorescenza – Confocale - Contrasto di fase – Olografia)
Applicazioni della fisica allo sviluppo di nuove tecnologie ottiche nelle biotecnologie
Tecniche microscopiche moderne (TIRFM – FLIM – FRET - Microscopia non-lineare – Microscopia Vibrazionale – Microscopia in Super-risoluzione)
Nuove tecnologie di singola molecola
Applicazioni della microscopia alla diagnostica dei tessuti
Applicazioni delle nuove tecnologie ottiche a studi di singola molecola
Applicazioni della microscopia alle neuroscienze
Competenze acquisite
Selezione della tecnica microscopica appropriata per l’indagine da effettuare.
Selezione ed uso delle ottiche di un microscopio (filtri, polarizzazione, epifluorescenza)
Selezione dei metodi di marcatura di un campione biologico per applicazione con vari metodi di microscopia, inclusa la super-risoluzione, rivelazione di singole molecole.
Uso di rivelatori
Trappole ottiche.
Acquisizione ed analisi quantitativa di immagini
Capacità acquisite al termine del corso:
Uso del microscopio, con varie metodologie di imaging
CFU: 6
Numero di ore totali del corso: 150 (= 6 x 25)
Numero di ore per studio personale e altre attività formative di tipo individuale: 98
Numero di ore relative alle attività in aula: 40
Numero di ore relative ad attività di laboratorio (lezioni in laboratorio): 12
Numero di ore relative ad attività di esercitazioni (in laboratorio e in campo): 0
Numero di ore relative ad attività seminariali: 0
Numero di ore relative ad attività di stage: 0
Numero di ore per prove in itinere: 0
Altre Informazioni
Orario di ricevimento
Martedi 9-11
Modalità di verifica apprendimento
Modalità: Verifica orale
Programma del corso
Luce e proprietà – Radiazione Elettromagnetica – Campo Elettromagnetico - Onde – Equazioni di Maxwell – Proprietà della Radiazione Elettromagnetica: monocromaticità, coerenza, polarizzazione - Dualismo onda-corpuscolo - Fotoni – Spettro ed Energia - Indice di rifrazione – Interferenza
Fondamenti di Ottica - Dominio dei tempi e delle frequenze: Cenni su trasformata di Fourier – Variabili coniugate – Vettore d’onda e numero d’onda – Propagazione nel vuoto – Campo evanescente e campo radiativo – Riflessione e Rifrazione – Principio di Fermat – Rifrazione ad una superficie sferica: diottro – Lente sottile – Lenti convergenti e divergenti – Cenni di ottica matriciale - Imaging: Sistema 2f, Sistema 4f, Ingrandimento, Risoluzione e Point Spread Function - Imaging con luce coerente ed incoerente
Molecole e interazione con luce - Struttura elettronica –Interazione con luce – Assorbimento – Scattering Rayleigh – Fluorescenza – Cenni di Spettroscopia – Spettri e Stokes shift - Struttura molecolare roto-vibrazionale – Scattering Raman – Fosforescenza – Intersystem crossing e Photo-bleaching
Microscopia in campo largo – Schematizzazione del microscopio – Trans ed Epi-illuminazione – Illuminazione: illuminazione critica vs illuminazione Koehler - Componenti del sistema di illuminazione (sorgenti di luce – condensatori - diaframmi) – Componenti del sistema di rivelazione (obiettivi ed aberrazioni, oculari, rivelatori) – Apertura Numerica – Risoluzione spaziale – Profondità di campo – Risoluzione assiale – Microscopia in fluorescenza – Filtri
Microscopia a scansione laser confocale – Assorbimento – Emissione spontanea – Emissione stimolata – Principio del Laser – Ottica del laser scanning – Laser scanning vs wide field – Microscopio confocale – Risoluzione spaziale – Sezionamento ottico – Sistemi di scansione (Disco di Nipkow – Specchi galvanometrici – Deflettori acusto-ottici – Specchi poligonali) – Rivelatori (fotodiodi – APD- fotomoltiplicatori) – Spectral imaging – Spectral unmixing
Applicazioni biologiche della fluorescenza - Immuno labeling –Preparazione campioni – Selezione anticorpi e fluorofori – Coloranti organici compartimento specifici – Selezione filtri - Genetic labeling – Proteine fluorescenti: GFP e varianti
Microscopia a Contrasto di fase – Concetti preliminari (Ampiezza e Intensità, Fase, Interferenza, Campione assorbente e campione trasparente, Phase shift) – Microscopia a contrasto di fase (principio) - Pupilla reale e complessa – Zernike phase contrast – Schlieren phase contrast – Dark field – Cenni sulla microscopia DIC – Elementi del microscopio a contrasto di fase - Esempi
Olografia digitale - Concetti preliminari (Interferenza di radiazione coerente) – Principio dell’Olografia digitale – Metodo di Fresnel – Metodo di Fourier – Olografia con ingrandimento – Olografia in riflessione e trasmissione – Metodi di ricostruzione – Phase stepping - Off-axis holography – Risoluzione in olografia – Esempi – Phase unwrapping e dual wavelength holography
Microscopia in fluorescenza (TIRFM – FLIM - FRET) – Rifrazione e Riflessione interna totale – Onda evanescente - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (principi base) – Schema ottico per la TIRFM – Applicazioni biologiche della TIRFM – Fluorescenza e Vita Media – Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy – FLIM nel dominio dei tempi – FLIM nel dominio delle frequenze – FRET (Foster Resonance Energy Transfer) – Accettore e Donatore – Interazione molecolare e trasferimento di energia – Efficienza e raggio di Foster – Quenching del donatore
Microscopia a due fotoni – Microscopia lineare e Microscopia non-lineare – Fluorescenza a due fotoni - Confronto con la microscopia Confocale – Risoluzione – Profondità di penetrazione – Sorgenti laser impulsate – Tessuti e fluorofori endogeni – Descanning e Non-descanning – Microscopia in Seconda-armonica – Somma coerente – Emissione angolare – Sorgenti endogene di SHG – Scansione in polarizzazione
Applicazioni della Microscopia TPEF – Microscopia non-lineare applicata ai tessuti biologici – Metodi per aumentare la profondità di penetrazione (Optical Clearing Agents) – Imaging non-lineare per fini diagnostici – Imaging dell’epitelio – Imaging dei tessuti connettivi – Applicazioni alla diagnostica di tessuti tumorali (morfologia – caratterizzazione spettrale – caratterizzazione della vita media) – Imaging di NADH e FAD – Effetto Warburg – Red-Ox imaging
Applicazioni della Microscopia SHG – Principi base della SHG – Hyper Rayleigh Scattering e SHG – Sorgenti endogene – Metodi di analisi di immagine - Forward e Backward SHG – Grey-level Co-occurrence matrix – FFT – Scansione in polarizzazione – Applicazioni all’imaging di: membrane cellulari, collagene, muscoli, tendini, cornea – Potenziali applicazioni cliniche
Microscopia Vibrazionale – Struttura molecolare – Scattering Rayleigh vs Scattering Raman – Spettroscopia Raman - Fingerprint molecolare - Micro-spettroscopia Raman – Clustering – Applicazioni – Coherent Antistokes Raman Scattering (CARS) microscopy – Principi del CARS – Sorgenti al ps – Detuning – Applicazioni – Imaging di lipidi – Imaging non-lineare multimodale – Schema ottico e limitazioni – Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy – Pump & Stokes – Modulazione e lock-in - Applicazioni
Super-risoluzione – Point Spread Function – Microscopia in deconvoluzione – Apertura Numerica – Microscopia 4Pi – Stimulated Total Emission Depletion (STED) microscopy – Principio ed esempi - Photo-Activable Localization Microscopy (PALM) - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) – Localizzazione di singoli fluorofori – Foto-attivazione - Principio di PALM e STORM – Esempi e applicazioni
Lezioni di laboratorio su:
- Applicazioni cliniche di microscopia non-lineare e spettroscopia – Interazione luce-tessuto – Dermoscopia multispettrale – Microscopia non-lineare di tessuti biologici risolta in tempo ed in frequenza – Sensori a fibra ottica - Spettroscopia di fluorescenza dei tessuti – Spettroscopia Raman dei tessuti – Applicazioni alla dermatologia
- Biofisica di singola molecola – Pinzette ottiche – Applicazioni allo studio dei motori molecolari - Single particle tracking
- Microscopia applicata alle neuroscienze – Nonlinear laser surgery – Propagazione di potenziali di membrana – Microscopia Random-access – Connettomica - Ultramicroscopia