Preparazione dei campioni. Metodi di studio e caratteristiche strutture proteine. Spettrofotometria, Spettrofluorimetria e chemioluminescenza, dicroismo circolare. L’enzimologia diagnostica. Cromatografia: principi, resine, cr. di partizione, HPLC, GC; cromatografia di affinità. Espressione di proteine ricombinanti. Elettroforesi (SDS-PAGE, IEF, 2D-EF, western blot) spettrometria di massa di metaboliti e proteine. Principi e tecniche di proteomica (sistematica, differenziale, funzionale
Libri di testo:
Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche. di K. Wilson and J. Walker. Raffaello cortina editore
Metodologie di base per le scienze biomolecolari- R. Reed, D. Holmes, j. Weyers, A. Jones. Zanichelli editore.
Obiettivi Formativi
Conoscenze:
Preparazione campioni, estrazione, purificazione. Fotometria e fluorimetria. Dosaggio di enzimi e metaboliti. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti e per lo studio delle proteine. Principi e basi tecniche per dosaggi enzimatici e di metaboliti nella pratica del laboratorio di biochimica. I dosaggi immunologici per la determinazione di ormoni, antigeni, metaboliti. Principali tecniche legate alla proteomica (elettroforesi e cromatografia bidimensionale, spettrometria di massa) . principi e applicazioni di proteomica differenziale e funzionale.
Competenze acquisite
Il corso è indirizzato a far acquisire allo studente le capacità per scegliere l’adeguata metodica per la determinazione analitica e preparativa di proteine, enzimi, metaboliti, ormoni. Viene affrontata anche la valutazione critica dei risultati ottenuti. Valutazione dell’importanza e dei limiti degli studi proteomici.
Capacità acquisite al termine del corso:
Gli studenti avranno la capacità di mettere a punto esperimenti di purificazione di proteine, dosaggi enzimatici, elettroforesi di DNA e proteine, tecniche di western blot.
Tecniche di elettroforesi bidimensionale e preparazione di campioni.
CFU: 6
Numero di ore totali del corso: 150 (= 6 x 25)
Numero di ore per studio personale e altre attività formative di tipo individuale:
Numero di ore relative alle attività in aula: 48
Numero di ore relative ad attività di laboratorio (lezioni in laboratorio): 12
Numero di ore relative ad attività di esercitazioni (in laboratorio e in campo):
Numero di ore relative ad attività seminariali: 0
Numero di ore relative ad attività di stage: 0
Numero di ore per prove in itinere: 0
Altre Informazioni
Frequenza delle lezioni ed esercitazioni:
frequenza fortemente consigliata
Strumenti a supporto della didattica
La strumentazione in dotazione presso il dipartimento di scienze biochimiche viene usata per effettuare lezioni dimostrative ed esercitazioni pratiche.
Orario di ricevimento
Mercoledì ore 11-13 e ore 16-18 presso il Dipartimento di Scienze Biochimiche, Viale Morgagni 50.
E’ possibile il ricevimento in altri orari previo appuntamento.
Modalità di verifica apprendimento
: prova orale riguardante gli argomenti affrontati e esposizione di un lavoro a scelta dello studente
Programma del corso
Principi di base
Unità di misura, soluzioni tampone, elettrodi a pH. Misure biochimiche quantitative. Metodi di calibrazione, standard interni.
Caratteristiche chimico fisiche degli aminoacidi, strutture primarie, secondarie e terziarie.
Principi di centrifugazione
Tecniche preparative e analitiche. Il coefficiente di sedimentazione, i g e gli rpm. Tipi di rotori. La centrifugazione in gradiente di densità. L’ultracentrifuga analitica.
Tecniche spettroscopiche
Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile: strumentazioni, applicazioni (dosaggio delle proteine) Spettrofluorimetria e chemioluminescenza: principi, strumentazione, applicazioni (dosaggi immunologici, l’uso di sonde fluorescenti la GFP, altri fluorofori sintetici, il microscopio a fluorescenza.
Proteine ricombinanti.
Clonazione e espressione di proteine in sistemi eterologhi (batteri, lieviti, cellule eucariote); strategie di produzione e purificazione. Caratterizzazione struttura/funzione di proteine ricombinanti.
Cromatografia, elettroforesi e spettrometria di massa negli studi proteomici.
Definizione e scopo della proteomica. La proteomica sistematica, funzionale e differenziale.
Tecniche cromatografiche:
Principi: coefficiente di partizione, numero di piatti teorici. Strumentazione. La cromatografia ad alta risoluzione (HPLC): strumentazione e vantaggi. Cromatografia di adsorbimento, partizione, gel filtrazione, scambio ionico e affinità: fasi stazionarie, sistemi di eluizione, applicazioni. Tecniche avanzate in cromatografia di partizione e affinità.
Metodi elettroforetici. Polimerizzazione di agarosio e poliacrilamide, preparazione di campioni, SDS-PAGE., Western blotting, immunoblotting, stripping, analisi immagine. Isoelettro-focalizzazione: con agarosio e anfoliti, con immobiline. Elettroforesi bidimensionale: strumentazione. Applicazioni: il progetto proteoma.
Spettrometria di massa:
Sensibilità e specificità Le sorgenti: ad urto elettronico (produzione di M+ e ioni frammento) applicazioni). Le sorgenti a ionizzazione “soft”: la sorgente FAB, la sorgente MALDI (la produzione di M+H+); la sorgente ESI (produzione di ioni multicarica). Analizzatori: a settore magnetico ed elettrico, quadrupolo, esapolo, trappola ionica, l’analizzatore FT-MS, l’analizzatore a tempo di volo. L’accoppiamento Gas-Cromatografia-Spettrometria di Massa. Gli strumenti MALDI/TOF, nano-HPLC-ESI Lo spettrometro MS/MS per la determinazione della sequenza dei peptidi.
Atre tecniche di proteomica:
la tecnica SELDI, le tecniche ICAT e DIGE per la proteomica differenziale. Principali tecniche di proteomica funzionale (modificazioni postraduzionali, interazioni proteina proteina, pull-down assay e il two hybrid system)
Metodi nel laboratorio di biochimica:
Metodi enzimatici per la determinazione quantitativa di enzimi e metaboliti. Proncipi del metodo: richiami alla cinetica enzimatica, metodo cinetico e metodo a termine. Calcolo delle U/mL e mg/mL. Uso di substrati sintetici e di reazioni accoppiate.
Esempi: dosaggio di transaminasi, creatin chinasi, deidrogenasi, glucosio, colesterolo, trigliceridi, creatinina.
I metodi immuno-enzimatici: RIA, IRMA ELISA, metodi in chemioluminescenza e in fluorescenza. Specificità e sensibilità della tecnica. Esempi: dosaggio di ormoni tiroidei, dosaggio di PTH, di citokine, dosaggio di Ab per il monitoraggio di malattie, dosaggio di marker tumorali.
Problematiche legate alla certificazione e al controllo di qualità del laboratorio di biochimica.