Tecniche per l'espressione eterologa e purificazione di proteine ricombinanti in vari organismi. Le esercitazioni di laboratorio saranno volte alla produzione di due proteine. Saranno poi effettuate alcune esercitazioni per la caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina e proteina-metallo tramite calorimetria CD e NMR. Le informazioni ottenute saranno successivamente utilizzate per ottenere il modello molecolare dell’addotto proteina-proteina tramite approcci computazionali
Non esistono testi di riferimento specifici.
Saranno forniti a lezione capitoli di libri e review article sui soggetti trattati.
Obiettivi Formativi
Conoscenza delle principali tecniche di biologia molecolare per l’ espressione e la purificazione di proteine ricombinanti. Tecniche per l’epsressione di proteine isotopicamente marcate. Conoscenza delle principali tecniche utilizzate per la caratterizzazione dell’interazione proteina-ione metallico, proteina-piccola molecola, proteina-proteina. Saper analizzare gli spettri elettronici, gli sprettri di dicroismo circolare e semplici spettri di risonanza magnetica. Conoscenza dei principali programmi computazionali per il docking molecolare.
Numero di ore relative alle attività in aula: 24 ore di insegnamento frontale e 36 ore di esercitazioni di laboratorio
Presentazioni power point delle lezioni. Affiancamento in laboratorio durante le esercitazioni
Altre Informazioni
Frequenza delle lezioni ed esercitazioni:
la frequenza alle esercitazioni di laboratorio e’ obbligatoria
Modalità di verifica apprendimento
L'esame prevede un colloquio orale volto a verificare la padronanza
dei concetti strutturali, cinetici e termodinamici che regolano le
interazioni biomolecolari e la conoscenza delle principali
metodologie sperimentali illustrate nei due moduli in cui si
compone il corso. La prova orale è unica per entrambi i moduli. Sarà verificata la comprensione e la capacità di
analisi critica delle attività svolte durante le esercitazioni di
laboratorio. Durante il colloquo sarà infine accertata la capacità
dello studente di applicare le conoscenze acquisite ad alcuni
problemi pratici proposti dai docenti.
Programma del corso
La prima parte del corso affrontera' alcuni aspetti della biologia molecolare che includono le tecniche di espressione eterologa di proteine: dal DNA genomico all'isolamento della proteina: basilari procedure di estrazione e di clonaggio di geni; le tecniche di over-espressione proteica in organismi batterici e eucariotici e in sistemi cell-free; tecniche di purificazione di proteine; modificazioni post-traslazionali di proteine e procedure di purificazione proteica.
Il corso inoltre si propone di far conoscere sperimentalmente quali sono le tecniche principali per lo studio delle interazioni proteina-proteina o proteina-piccola molecola o proteina-ione metallico. Verrà svoltà una esercitazione di calorimetria (ITC) con la quale verrà analizzato come ricavare i parametri termodinamici che caratterizzano una interazione. Una esercitazione di dicroismo circolare e tramite NMR verrà caratterizzata l’interazione fra due proteine che gli studenti avranno prodotto e purificato in laboratorio. In particolare l’esercitazione prevede l’acquisizione ed analisi degli esperimenti NMR tipo HSQC e mappatura delle variazioni dei chemical shifts sulla struttura delle due proteine in esame. I dati ottenuti verrano analizzati e utilizzati come input in programmi di docking per ottenere un modello strutturale del complesso