Funzione biologica delle proteine e caratteristiche chimiche. Struttura delle proteine. Applicazioni biotecnologiche dello studio della relazione struttura e funzione delle proteine: analisi delle interazioni proteina-proteina e proteina-ligando, biocatalisi ed enzimi di interesse industriale, drug design. Produzione di proteine ricombinanti. Purificazione di proteine mediante tecniche cromatografiche avanzate. Esempi di proteine ricombinanti ad uso terapeutico e industriale
Walsh G. "Proteins: Biochemistry and Biotechnology", 2nd Edition
Lutz S. & Bornscheuer U. T. "Protein Engineering Handbook, 1 & Volume 2". Wiley Online Library (PDF)
Arndt K.M. & Muller KM "Protein engineering protocols (Methods in Molecular Biology)" (PDF) (Humana Press)
Obiettivi Formativi
Il corso ha l’obiettivo di spiegare i meccanismi molecolari alla base del rapporto struttura-funzione delle proteine e gli approcci sperimentali che permettono di modulare la funzionalità proteica e l’acquisizione di funzioni/strutture desiderate.
Il corso si propone di fornire le conoscenze delle diverse tecniche che vengono applicate nell’ingegneria di proteine ad applicazione biotecnologica: progettazione ex novo di strutture proteiche, disegno razionale per la progettazione di nuove funzioni, modelling molecolare e docking, mutagenesi (sito-diretta e random) nonché dei metodi attraverso i quali è possibile isolare le varianti proteiche ottimizzate per una determinata proprietà. Inoltre verranno presentati i diversi sistemi di espressione utilizzati nella produzione di proteine ricombinanti di diversa provenienza. Gli studenti saranno stimolati a valutare quali siano i vantaggi e i limiti dei vari approcci di modificazione delle proprietà delle proteine e quelli connessi all’utilizzo dei diversi sistemi di espressione eterologa. Il corso prevede di approfondire alcuni casi di studio, relativi alle loro applicazioni terapeutiche e industriali.
Le nozioni apprese dagli studenti permetteranno loro di acquisire capacità decisionali in un progetto di “protein engineering”, dalla fase di progettazione a quella della produzione delle varianti proteiche ricombinanti, e di saper affrontare e risolvere le diverse problematicità legate al processo.
Prerequisiti
Gli studenti che accedono a questo corso possiedono conoscenze di: Chimica generale, Biochimica generale e Biologia Molecolare, con particolare riferimento alle proprietà delle proteine e degli acidi nucleici.
Metodi Didattici
Presentazioni PowerPoint
Lezioni frontali
Altre Informazioni
Le presentazioni PowerPoint utilizzate durante le lezioni saranno a disposizione degli studenti in formato PDF. Agli studenti saranno inoltre fornite le pubblicazioni scientifiche originali da cui sono tratte le lezioni medesime.
Modalità di verifica apprendimento
L’esame consisterà in una prova orale volto a valutare:
1. Conoscenza e comprensione delle basi teoriche del rapporto struttura-funzione nelle proteine.
2. Capacità di applicare le conoscenze acquisite per sviluppare un progetto di ingegneria proteica.
3. Capacità di estrarre informazione da un testo scientifico e di individuare gli aspetti critici.
4. Possesso di conoscenze di carattere quantitativo per descrivere a livello molecolare e matematico i fenomeni biologici.
Programma del corso
- Rapporto struttura e funzione nelle proteine
- Introduzione alla struttura della proteine
- Classificazione strutturale delle proteine
- La sintesi proteica: meccanismi e regolazione
- Metodi sperimentali e in silico di determinazione della struttura delle proteine
- Modifiche post-traduzionali e protein targeting
- Protein folding (in vitro e in vivo)
- Degradazione delle proteine (sistema lisosomiale e proteasomico, autofagia)
Ingegneria Proteica: rational design
- De novo protein design (di strutture e funzioni): metodi ed esempi
- Rational design: teoria e metodi sperimentali. Esempi
- Molecular docking: teoria ed esempi
- Ingegnerizzazione della stabilità delle proteine: teoria, metodi ed esempi
- Irrational design: evoluzione diretta, metodi basati sull’omologia di sequenza
- Irrational design: metodi combinatoriali indipendenti dall’omologia di sequenza
- Selezione e Screening: procedure che consentono di valutare varianti enzimatiche generate e di isolare quelle ottimizzate per una determinata proprietà di interesse.
- Introduzione alla produzione di proteine ricombinanti
- Tecniche di clonaggio e vettori di espressione
- Sistemi “cell free” per l’espressione di proteine
- Espressione in sistemi procariotici (Gram negativi e Gram positivi)
- Espressione in E. coli
- Strategie per aumentare l’espressione delle proteine solubili: procedure da adottare per minimizzare la formazione di corpi di inclusione. Utilizzo dei tag per aumentare l'espressione, la solubilita e facilitare il processo di purificazione.
- Espressione in sistemi eucariotici: Pichia, Saccharomyces etc.
- Espressione in sistemi eucariotici: cellule di insetto e di mammifero.
- Criteri di scelta dell’ospite
- Cenni sulle strategie di refolding dai corpi di inclusione.
- Metodi di purificazione con la cromatografia e metodi per valutare e caratterizzare le proteine prodotte.
- Proteine ricombinanti ad uso terapeutico e industriale. Anticorpi terapeutici. Immunotossine chimeriche. Proteine fluorescenti. Proteine chimeriche per la microscopia elettronica a temperature criogeniche (Cryo-EM)